การหาลำดับกรดอะมิโนในอินซูลิน

น็อยเบอร์เกอร์ย้ายไปประจำที่สถาบันแห่งชาติเพื่อการวิจัยทางการแพทย์ในกรุงลอนดอน แต่แซงเงอร์เลือกที่จะอยู่ที่เคมบริดจ์ต่อ ใน ค.ศ. 1943 แซงเงอร์เข้ากลุ่มวิจัยของชาลส์ ชิบนอลล์ นักเคมีโปรตีนผู้ซึ่งเพิ่งเข้ารับตำแหน่งหัวหน้าภาควิชาชีวเคมี[12] ชิบนอลล์ได้เริ่มงานบางส่วนในการหาลำดับกรดอะมิโนในอินซูลินจากวัว[13] และเสนอให้แซงเงอร์ดูหมู่อะมิโนในโปรตีน อินซูลินสามารถหาซื้อได้จากร้านขายยาในสหราชอาณาจักร และเป็นโปรตีนบริสุทธิ์ไม่กี่ชนิดที่สามารถหาซื้อได้ แซงเงอร์ออกทุนสำหรับวิจัยเองในช่วงแรกก่อนที่จะได้รับทุนสนับสนุนจากสภาการวิจัยทางการแพทย์จนถึง ค.ศ. 1944 และระหว่าง ค.ศ. 1944 และ 1951 เขาได้รับทุนจากกองทุนวิจัยทางการแพทย์อนุสรณ์ไบท์[5]

ความสำเร็จสำคัญประการแรกของแซงเงอร์ได้แก่การหาลำดับกรดอะมิโนทั้งหมดภายในสายพอลิเพปไทด์สองสายของอินซูลินจากวัว (เอและบี) โดยสายเอทำสำเร็จใน ค.ศ. 1952 ส่วนสายบีสำเร็จก่อนหน้านั้นหนึ่งปี[14][15] ก่อนหน้านี้นักวิทยาศาสตร์เชื่อว่าโครงสร้างของโปรตีนนั้นไม่เป็นระเบียบ อย่างไรก็ตาม แซงเงอร์พิสูจน์ว่ามีโครงสร้างและองค์ประกอบทางเคมีที่ชัดเจน[6]

ในการหาลำดับกรดอะมิโน แซงเงอร์ใช้เทคนิคโครมาโทกราฟีแบบแบ่งส่วนซึ่งพัฒนาโดยริชาร์ด ลอว์เรนซ์ มิลลิงตัน ซินจ์และอาร์เชอร์ มาร์ติน แซงเงอร์ใช้ 1-ฟลูออโร-2,4-ไดไนโตรเบนซีน (ซึ่งต่อมาเรียกว่า "รีเอเจนต์ของแซงเงอร์" ชื่ออื่น ๆ ได้แก่ "ฟลูออโรไดไนโตรเบนซีน" หรือเอฟดีเอ็นบี) ซึ่งใช้ได้ผลดีในการติดฉลากเอ็น-เทอร์มินัสของเพปไทด์[16] จากนั้นจึงไฮโดรไลส์บางส่วนเพื่อให้อินซูลินกลายเป็นเพปไทด์สายสั้น ๆ โดยใช้กรดไฮโดรคลอริกหรือเอนไซม์เช่นทริปซิน เพปไทด์ผสมที่ได้หลังจากนั้นถูกนำไปแยกในสองทิศทางบนกระดาษกรอง โดยครั้งแรกใช้อิเล็กโตรโฟรีซิสก่อนจะใช้โครมาโทกราฟีเพื่อแยกต่อในทิศทางตั้งฉากกับครั้งแรก สายเพปไทด์ต่างชนิดกันซึ่งถูกตรวจจับโดยใช้นินไฮดรินจะเคลื่อนที่ไปยังบริเวณต่าง ๆ บนกระดาษ ทำให้เกิดเป็นรูปแบบที่แซงเงอร์เรียกว่า "ลายนิ้วมือ" สายเพปไทด์จากเอ็น-เทอร์มินัสซึ่งถูกติดฉลากโดยเอฟดีเอ็นบีจะปรากฏให้เห็นเป็นสีเหลือง และกรดอะมิโนที่เอ็น-เทอร์มินัสสามารถวิเคราะห์หาได้จากการไฮโดรไลซิสสายเพปไทด์ให้เป็นกรดอะมิโนทั้งหมดและดูว่ากรดอะมิโนใดที่กลายเป็นอนุพันธ์เอฟดีเอ็นบี[6]

แซงเงอร์ใช้กระบวนการดังกล่าวซ้ำ ๆ โดยเปลี่ยนวิธีการไฮโดรไลซิสบางส่วนในช่วงแรก ข้อมูลที่ได้จากกระบวนการดังกล่าวนี้สามารถนำไปประกอบกันเป็นสำดับกรดอะมิโนที่สมบูรณ์ได้ ในท้ายที่สุด เนื่องจากอินซูลินสายเอและสายบีจะไม่ออกฤทธิ์ในทางสรีรวิทยาถ้าไม่มีพันธะไดซัลไฟด์สามพันธะ (สองพันธะระหว่างสายเอและสายบี และอีกหนึ่งพันธะภายในสายเอ) แซงเงอร์และคณะสามารถสรุปโครงสร้างของอินซูลินอย่างสมบูรณ์ใน ค.ศ. 1955[17][18] ข้อสรุปของแซงเงอร์ได้แก่สายพอลิเพปไทด์ทั้งสองสายของอินซูลินมีลำดับกรดอะมิโนที่ชัดเจนและแน่นอน และสามารถขยายต่อไปยังโปรตีนชนดอื่น ๆ ได้ ซึ่งเป็นผลงานที่ทำให้เขาได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีครั้งแรกใน ค.ศ. 1958[19] การค้นพบนี้มีส่วนสำคัญให้ฟรานซิส คริกพัฒนาแนวคิดสำหรับโครงสร้างของดีเอ็นเอ[20]

การหาลำดับอาร์เอ็นเอ

แซงเงอร์เป็นสมาชิกของนักวิจัยภายนอกประจำสภาการวิจัยทางการแพทย์ ตั้งแต่ ค.ศ. 1951[5] และต่อมาเมื่อสภาการวิจัยทางการแพทย์ได้สถาปนาห้องปฏิบัติการชีววิทยาโมเลกุลใน ค.ศ. 1962 แซงเงอร์ได้ย้ายห้องปฏิบัติการจากภาควิชาชีวเคมีไปยังชั้นบนสุดของอาคารห้องปฏิบัติการดังกล่าว และเขาขึ้นดำรงตำแหน่งหัวหน้าแผนกเคมีโปรตีน[6] แต่ก่อนที่เขาจะย้ายไปนั้นเขาเริ่มสนใจความเป็นไปได้ในการหาลำดับอาร์เอ็นเอและเริ่มพัฒนาวิธีการแยกชิ้นส่วนของไรโบนิวคลีโอไทด์โดยใช้เอนไซม์นิวคลีเอส[20]

อุปสรรคสำคัญในการทำงานนี้มาจากการหาแหล่งอาร์เอ็นเอที่บริสุทธิ์พอที่จะวิเคราะห์ได้ ใน ค.ศ. 1964 แซงเงอร์และเชลด์ มาร์กเคอร์ค้นพบฟอร์มิลเมไทโอนีนทีอาร์เอ็นเอซึ่งเริ่มการสังเคราะห์โปรตีนในแบคทีเรีย[21] อย่างไรก็ตาม ผู้ที่สามารถหาลำดับทีอาร์เอ็นเอได้สำเร็จไม่ใช่แซงเงอร์แต่เป็นรอเบิร์ต ดับเบิลยู. ฮอลลีย์และคณะจากมหาวิทยาลัยคอร์เนลซึ่งเผยแพร่ลำดับของไรโบนิวคลีโอไทด์ 77 โมเลกุลที่ประกอบกันเป็นอะลานีนทีอาร์เอ็นเอจาก Saccharomyces cerevisiae ใน ค.ศ. 1965[22] ใน ค.ศ. 1967 กลุ่มวิจัยของแซงเงอร์สามารถวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 5S ไรโบโซมอล อาร์เอ็นเอ จาก Escherichia coli ซึ่งมีนิวคลีโอไทด์จำนวน 120 โมเลกุล[23]

การหาลำดับดีเอ็นเอ

แซงเงอร์ได้เปลี่ยนไปวิจัยหาลำดับดีเอ็นเอซึ่งใช้เทคนิคที่แตกต่างกันอย่างสิ้นเชิง เขาศึกษาวิธีการต่าง ๆ เพื่อใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส I จากเชื้อ อี. โคไล เพื่อคัดลอกดีเอ็นเอสายเดี่ยว[24] ใน ค.ศ. 1975 แซงเงอร์ร่วมกับอลัน คูลสัน ได้ตีพิมพ์ผลงานหาลำดับดีเอ็นเอโดยใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสและนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากกัมมันตรังสี ซึ่งแซงเงอร์เรียกว่าเทคนิค "บวกและลบ"[25][26] กระบวนการดังกล่าวใช้สองวิธีที่เกี่ยวข้องกันเพื่อสังเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์สายสั้นที่มีปลาย 3' ระบุชัดเจน ซึ่งสามารถนำไปแยกโดยวิธีอิเล็กโตรโฟรีซิสโดยใช้เจลพอลิอะคริลาไมด์ก่อนนำไปวิเคราะห์ด้วยการถ่ายภาพรังสีต่อไป กระบวนการดังกล่าวนี้สามารถหาลำดับนิวคลีโอไทด์ได้ถึง 80 นิวคลีโอไทด์ในครั้งเดียว และถือเป็นการปรับปรุงจากเดิมอย่างมาก แต่ก็ยังเป็นวิธีที่ต้องทำงานอย่างหนัก อย่างไรก็ตาม กลุ่มของแซงเงอร์สามารถหาลำดับในแบคเทอริโอเฟจΦX174 ซึ่งมีจำนวน 5,386 นิวคลีโอไทด์ได้เกือบทั้งหมด[27] ซึ่งเป็นการทำจีโนมดีเอ็นเอเป็นครั้งแรก พวกเขายังค้นพบว่าบริเวณในการสังเคราะห์โปรตีนสามารถซ้อนทับกันได้[3]

ใน ค.ศ. 1977 แซงเงอร์และคณะนำเสนอการใช้อนุพันธ์ไดดีออกซีในการหยุดการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอซึ่งเรียกว่า "วิธีแซงเงอร์"[26][28] ซึ่งเป็นการค้นพบที่สำคัญและสามารถหาลำดับภายในสายดีเอ็นเอที่ยาวได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำ ซึ่งทำให้เขาได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีอีกครั้งใน ค.ศ. 1980 ร่วมกับวอลเทอร์ กิลเบิร์ตและพอล เบิร์ก[29] แซงเงอร์และคณะใช้วิธีการนี้ในการหาลำดับของดีเอ็นเอของไมโทคอนเดรียในมนุษย์ (16,569 คู่เบส)[30] และของแลมบ์ดาเฟจ (48,502 คู่เบส)[31] วิธีแซงเงอร์นี้ได้นำไปใช้ในการทำจีโนมมนุษย์[32]

นักศึกษาปริญญาเอก

ในช่วงที่แซงเงอร์เป็นนักวิจัยนั้น เขาเป็นที่ปรึกษาให้กับนักศึกษาปริญญาเอกมากกว่าสิบคน ซึ่งสองคนในนั้นได้รับรางวัลโนเบลในเวลาต่อมา นักศึกษาคนแรกของเขาคือรอดนีย์ พอร์เทอร์ซึ่งเข้าร่วมกลุ่มวิจัยใน ค.ศ. 1947[3] พอร์เทอร์ได้รับรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ใน ค.ศ. 1972 ร่วมกับเจอรัลด์ เอเดิลมันจากผลงานการหาโครงสร้างทางเคมีของแอนติบอดี[33] เอลิซาเบธ แบล็กเบิร์นเป็นนักศึกษาปริญญาเอกในกลุ่มวิจัยของแซงเงอร์ระหว่าง ค.ศ. 1971 และ 1974[3][34] เธอได้รับรางวัลโนเบลสาขาสรีรวิทยาหรือการแพทย์ใน ค.ศ. 2009 ร่วมกับแครอล ดับเบิลยู. ไกรเดอร์และแจ็ก ดับเบิลยู. ชุสตัก จากผลงานในการศึกษาเทโลเมียร์และเอนไซม์เทโลเมอเรส[35]

กฎของแซงเงอร์

กฎของแซงเงอร์มีใจความว่า

... anytime you get technical development that’s two to threefold or more efficient, accurate, cheaper, a whole range of experiments opens up.[36]

ซึ่งแปลเป็นไทยได้ว่า

... เมื่อใดก็ตามที่คุณพัฒนาเทคนิคที่มีประสิทธิภาพกว่าเดิม แม่นยำกว่าเดิม ถูกกว่าเดิมประมาณสองหรือสามเท่า ก็จะเปิดโอกาสให้มีการทดลองใหม่ ๆ หลายร้อยหลายพันอย่าง

กฎนี้ไม่ควรสับสนกับกฎของเทร์เรนซ์ แซงเงอร์ในวิทยาการคอมพิวเตอร์ซึ่งมีที่มาจากกฎของเอร์กกี โอยา นักวิทยาการคอมพิวเตอร์ชาวฟินแลนด์

รางวัลและการเชิดชูเกียรติ

แซงเงอร์เป็นเพียงหนึ่งในสองคนเท่านั้นที่ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีสองครั้ง (อีกคนได้แก่คาร์ล แบร์รี ชาร์เพลสใน ค.ศ. 2001 และ 2022) และเป็นเพียงหนึ่งในห้าคนที่ได้รับรางวัลโนเบลสองครั้ง อีกสามคนที่เหลือได้แก่มารี กูว์รี (สาขาฟิสิกส์ใน ค.ศ. 1903 และสาขาเคมีใน ค.ศ. 1911) ไลนัส พอลิง (สาขาเคมีใน ค.ศ. 1954 และสาขาสันติภาพใน ค.ศ. 1962) และจอห์น บาร์ดีน (สาขาฟิสิกส์สองครั้งใน ค.ศ. 1956 และ ค.ศ. 1972)[4]

สถาบันเวลล์คัมแซงเงอร์ ตั้งชื่อตามแซงเงอร์เพื่อให้เกียรติแก่เขา[3]